ДНК-идентификация (также известная как типирование ДНК или генная идентификация) позволяет установить, принадлежат ли исследуемые образцы ДНК одному и тому же лицу, родственникам или людям, не связанным родством. Его чувствительность произвела переворот в судебной медицине, особенно в установлении отцовства и идентификации преступников. Типирование ДНК также все чаще применяется при изучении генетических изменений и наследственных болезней.
Генетические вариации
В генетическом плане все люди примерно на 99,9% идентичны. Однако так как ДНК каждой клетки состоит из трех миллиардов комплементарных (взаимодополняющих) пар азотистых оснований (нуклеотидов), даже 0,1% разницы означает, что три миллиона из них у двух не связанных родством человек не совпадут.
Часть этих несовпадений приходится на участки хромосомы (локусы), содержащие так называемые повторяющиеся последовательности нуклеотидов, то есть последовательности, представленные в геномном наборе множественными копиями. ДНК одного человека может содержать две такие копии, в то время как у другого их, например, 20.
Это различие и лежит в основе метода типирования ДНК. Количество последовательностей нуклеотидов не изменяется при передаче следующему поколению. Поэтому генетически связанные люди будут иметь большее число совпадений повторяющихся последовательностей, чем не связанные родством. Например, ребенок наследует по 50% совпадений от каждого из родителей, а у однояйцевых близнецов набор повторяющихся последовательностей будет идентичным.
Анализируя количество повторяющихся последовательностей в нескольких локусах, можно установить генетическую связь между людьми.
Использование ДНК-идентификации
В судебной медицине ДНК-идентификация применяется в первую очередь для подтверждения виновности подозреваемого в преступлении. ДНК, выделенная из крови, волос, спермы или других образцов, обнаруженных на месте преступления, очищается и сравнивается с образцами, взятыми у подозреваемого.
В отличие от старых методов судебно-медицинской экспертизы, ДНК-идентификация является более точной и чувствительной. Например, конверт, который лизнул подозреваемый, содержит достаточно ДНК для анализа. Примерно в трети случаев это позволяет исключить подозреваемых, освобождая сотрудников полиции для работы по другим направлениям.
Другая область применения ДНК-идентификации - установление генетического родства в спорных случаях. Так как ребенок наследует 50% ДНК каждого из родителей, картина повторяющихся последовательностей позволяет установить материнство или отцовство. Эта картина настолько специфическая, что повторяющиеся последовательности отца или матери можно восстановить, изучив ДНК детей. Результаты будут тем точнее, чем больше детей исследовано. Также ДНК-идентификация может быть использована для подтверждения более отдаленного родства. Так как ДНК - сравнительно устойчивая молекула, проследить родословную можно, даже если большинство членов семьи уже умерли.
Методика ДНК-идентификации
Метод ДНК-идентификации основан на амплификации (размножении) специфических повторяющихся последовательностей. Как только достаточное количество исследуемых фрагментов ДНК получено, образец может быть визуализирован для сравнения с контрольным.
Возможность использовать для исследования микроскопические количества образцов (крови, спермы, волос и т.д.) появилась благодаря изобретению метода амплификации повторяющихся последовательностей. Для этого используется так называемая полимеразная цепная реакция (ПЦР). За создание этого метода Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия. Для амплификации используются короткие фрагменты синтетической ДНК, комплементарные концам размножаемых фрагментов нити ДНК (праймеры), и фермент ДНК-полимераза. В каждом цикле репликации количество фрагментов удваивается, таким образом 25 циклов позволят увеличить их содержание в миллион раз.
Методика амплификации ДНК
1. ДНК извлекается из образца с места преступления, например пятен крови.
2. Молекула ДНК состоит из двух комплементарных цепочек, которые содержат повторяющиеся последовательности (показаны желтым). Они уникальны для каждого человека и наследуются предсказуемым образом.
3. При нагреве смеси до 94°С ДНК денатурирует и цепочки разделяются. Добавляются синтетические праймеры, комплементарные концам амплифицируемых фрагментов.
4. Смесь охлаждается до 55-66°С. Праймеры присоединяются к концам амплифицируемого фрагмента ДНК.
5. Добавляется ДНК-полимераза. Она синтезирует комплементарную цепочку ДНК, начиная с праймеров. Таким образом, созданы две копии цепочки, содержащие повторяющиеся последовательности. Этапы 3-5 повторяются около 30 раз. В результате получается около миллиона копий повторяющейся последовательности.
6. Фрагменты разделяются по размеру путем электрофореза в геле. Длина амплифицированного фрагмента из образца с места преступления и контрольного образца сравниваются.
7. Когда исследуемые образцы выделены, может быть установлен их размер. В данном случае установлено совпадение фрагментов, полученных из ДНК подозреваемого под номером 2 и выделенных из образцов с места преступления.
Уникальная картина
Амплифицированные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза (движения частиц под воздействием электрического поля) в слое геля. Чем крупнее фрагмент, тем меньшее расстояние он пройдет. После этого образец окрашивают специальным красителем. Полученная картина в виде набора полосок будет уникальной для каждого человека.
На схеме справа показано выделение одной повторяющейся последовательности. Однако на практике анализируется совпадение по нескольким фрагментам. Положительное заключение дается, если длина амплифицированных фрагментов ДНК, извлеченных у подозреваемого и полученых из образцов с места преступления, точно совпадает.
Как проходит исследование ДНК
При ДНК-идентификации ДНК, извлеченная из контрольных образцов, сравнивается с исследуемой. Изучаемые повторяющиеся последовательности амплифицируются с помощью полимеразной цепной реакции и разделяются по размеру путем электрофореза в геле. Полученный образец окрашивается специальным красителем. Если длины всех фрагментов, полученных из ДНК исследуемого и контрольного образца, совпадают, эти образцы с большой вероятностью принадлежат одному и тому же лицу. Совпадение образцов на 50% позволяет сделать вывод о материнстве или отцовстве.
Насколько достоверна ДНК-идентификация
По теории вероятности два не связанных друг с другом образца все же могут совпасть. Поэтому идентификация будет тем точнее, чем большее количество повторяющихся последовательностей сравнивается. Обычно в одном тесте исследуется 8-10 специфических повторяющихся последовательностей.
На точность идентификации могут влиять и другие факторы. Например, члены некоторых расовых или этнических групп могут иметь одинаковое количество некоторых повторяющихся последовательностей. Этого можно избежать, увеличив число исследуемых повторяющихся последовательностей. Лаборатории должны стараться подтвердить положительное заключение, исследуя другие повторяющиеся последовательности и, при возможности, дополнительные образцы.
Тело человека. Снаружи и внутри. №29 2009